BD_FACSCalibur流式細(xì)胞儀是一種強大的單細(xì)胞分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、干細(xì)胞研究和藥物開發(fā)等領(lǐng)域。它能夠快速、高效地對細(xì)胞或微粒進(jìn)行多參數(shù)檢測，并提供定量和定性分析。
工作原理
BD_FACSCalibur流式細(xì)胞儀的核心原理是利用激光束照射單個細(xì)胞，并通過檢測散射光和熒光信號來分析細(xì)胞的物理和生化特性。其基本工作流程如下：
1.樣本制備：待測細(xì)胞或微粒被熒光標(biāo)記（如抗體偶聯(lián)熒光染料）后制成單細(xì)胞懸液。
2.流體聚焦：樣本通過鞘液包裹，形成單細(xì)胞流，確保細(xì)胞逐個通過檢測區(qū)。
3.激光激發(fā)：細(xì)胞流經(jīng)激光束時，熒光染料被激發(fā)并發(fā)射特定波長的光。
4.信號檢測：
-前向散射光（FSC）：反映細(xì)胞大小。
-側(cè)向散射光（SSC）：反映細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜度（如顆粒度）。
-熒光信號：反映特定分子（如表面標(biāo)志物、胞內(nèi)蛋白）的表達(dá)水平。
5.數(shù)據(jù)分析：計算機系統(tǒng)收集信號，通過軟件（如FlowJo、FCSExpress）進(jìn)行統(tǒng)計和可視化分析。
在細(xì)胞表型分析中的應(yīng)用
細(xì)胞表型分析是流式細(xì)胞儀經(jīng)典的應(yīng)用之一，主要用于鑒定和分類不同細(xì)胞亞群。例如：
1.免疫細(xì)胞分型
在免疫學(xué)研究中，流式細(xì)胞儀可區(qū)分T細(xì)胞（CD3+）、B細(xì)胞（CD19+）、NK細(xì)胞（CD56+）等，并進(jìn)一步細(xì)分亞群（如CD4+輔助T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞）。通過多色熒光標(biāo)記（如10色以上流式），可以同時分析多種表面標(biāo)志物，揭示免疫系統(tǒng)的精細(xì)調(diào)控機制。
2.腫瘤細(xì)胞鑒定
在白血病和淋巴瘤診斷中，流式細(xì)胞儀通過檢測腫瘤特異性抗原（如CD34、CD19、CD5）輔助分型。例如，急性髓系白血?。ˋML）細(xì)胞可能高表達(dá)CD33和CD117，而慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）細(xì)胞則常表達(dá)CD5和CD23。
3.干細(xì)胞研究
流式細(xì)胞儀可用于分離和鑒定干細(xì)胞（如CD34+造血干細(xì)胞），并監(jiān)測其分化狀態(tài)。結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（如OCT4、SOX2）的胞內(nèi)染色，可評估干細(xì)胞的“干性”維持情況。
在細(xì)胞功能分析中的應(yīng)用
除了表型分析，流式細(xì)胞儀還能動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞功能，包括：
1.細(xì)胞周期與增殖
通過DNA染料（如PI、DAPI）染色，流式細(xì)胞儀可分析細(xì)胞周期分布（G0/G1、S、G2/M期）。此外，增殖染料（如CFSE）可追蹤細(xì)胞分裂次數(shù)。
2.細(xì)胞凋亡與死亡
AnnexinV-FITC/PI雙染可區(qū)分早期凋亡（AnnexinV+PI−）和晚期凋亡/壞死（AnnexinV+PI+）。Caspase活性檢測則進(jìn)一步揭示凋亡通路激活情況。
3.細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子與信號通路
通過破膜固定技術(shù)，可檢測胞內(nèi)因子（如IFN-γ、IL-2）或磷酸化蛋白（如p-STAT3），評估免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)。例如，Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡分析有助于理解自身免疫疾病機制。
4.鈣流與活性氧（ROS）檢測
熒光探針（如Fluo-3、DCFH-DA）可實時監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度或氧化應(yīng)激水平，用于藥理學(xué)或毒理學(xué)研究。
技術(shù)進(jìn)展
近年來，BD_FACSCalibur流式細(xì)胞儀技術(shù)不斷革新，主要包括：
1.質(zhì)譜流式（CyTOF）：用金屬同位素替代熒光染料，突破傳統(tǒng)熒光通道限制，實現(xiàn)40+參數(shù)檢測。
2.光譜流式：通過全光譜解析，減少熒光串?dāng)_，提高多色實驗準(zhǔn)確性。
3.成像流式：結(jié)合顯微鏡功能，在獲取熒光數(shù)據(jù)的同時記錄細(xì)胞形態(tài)。
4.微流控芯片：實現(xiàn)低成本、便攜式細(xì)胞分析，適用于床邊檢測（POCT）。
